原位雜交組織化學(xué)技術(shù)

原位雜交組織化學(xué)技術(shù)(in situ hybridization histochemistry；ISHH)簡(jiǎn)稱原位雜交，是一種在組織細(xì)胞原位進(jìn)行的核酸分子雜交技術(shù)，敏感度高，特異性強(qiáng)，是當(dāng)前分子生物學(xué)研究的重要手段。
一、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)技術(shù)原理
原位雜交技術(shù)是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。
經(jīng)特定標(biāo)記的核苷酸鏈為探針，可與組織切片、細(xì)胞或染色體標(biāo)本中的待檢DNA片段或mRNA進(jìn)行雜交，然后顯示標(biāo)記物，從而分析待檢核酸的分布和含量。利用此項(xiàng)技術(shù)可研究各種基因在染色體上的定位，編碼某種蛋白質(zhì)的mRNA在胞質(zhì)中的表達(dá)。
二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)核酸探針的應(yīng)用
（一）探針的分類
1.按所帶標(biāo)記物，探針可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類。目前，大多數(shù)放射性標(biāo)記法是通過酶促反應(yīng)將標(biāo)記的基因摻入DNA中，常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高，背景較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前*常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。
2.按核酸不同性質(zhì)，探針又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cDNA探針又可分為雙鏈cDNA探針和單鏈cDNA探針。
（二）探針的選擇
根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針、RNA探針或寡核苷酸探針。
長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交，因?yàn)樗灰淄高^細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。
（三）探針的標(biāo)記
在選擇探針類型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。
三、原位雜交技術(shù)的基本方法
原位雜交技術(shù)方法大致可分為：1.雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；2.雜交；3.雜交后處理；4.顯示（visualization）：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。
（一）固定
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個(gè)方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，*大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對(duì)穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。
因此，對(duì)于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到*低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。
（二）玻片和組織切片的處理
1．玻片的處理
玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度*好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，多聚賴氨酸液。
2．增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性
此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長(zhǎng)度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑。增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。
這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存*和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。
3．減低背景染色
在原位雜交實(shí)驗(yàn)程序中，如何減低背景染色是一個(gè)重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素造成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。
預(yù)雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。
4．防止RNA酶的污染
由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程都需戴**手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240℃）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其*低溫度必須在150℃左右。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓**處理。
（三）雜交（Hybridisation）
在ISHH，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期是比較長(zhǎng)的，實(shí)驗(yàn)程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個(gè)實(shí)驗(yàn)中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是*重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。
雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。為保證雜交所需的濕潤(rùn)環(huán)境，可將其放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standardsaline citrate,SSC）溶液的硬塑料盒中進(jìn)行孵育。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。
（四）雜交后處理（post hybridisationtreatment）
雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。
（五）顯示（Visualization）
根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測(cè)定，如放射自顯影可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測(cè)儀（computer-assistedimageanalysis）檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀對(duì)不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。
（六）對(duì)照實(shí)驗(yàn)和ISHH結(jié)果的判斷
和其它實(shí)驗(yàn)方法一樣，必須同時(shí)設(shè)對(duì)照試驗(yàn)以證明其實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性。對(duì)照試驗(yàn)的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定。
ISHH的*大優(yōu)點(diǎn)是它的高度特異性，它可測(cè)定組織、培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNA探針在理想的ISHH的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)mRNA，其敏感度可達(dá)到20個(gè)mRNA拷貝/每個(gè)細(xì)胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時(shí)很少發(fā)生丟失，降解，其敏感性高到能夠顯示在染色體鋪片上，有時(shí)甚至在組織切片上的單個(gè)基因拷貝。
正因?yàn)槿绱?，?duì)ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報(bào)告過的新發(fā)現(xiàn)。